【类型】期刊

【作者】田国杰，王晗，陈立红（内蒙古农业大学农学院）

【作者单位】内蒙古农业大学农学院

【刊名】内蒙古林业科技

【关键词】 赤峰；固氮菌；16S；rDNA

【资助项】国家自然科学基金项目

【ISSN号】1007-4066

【页码】P21-26

【年份】2019

【期号】第1期

【摘要】用阿须贝培养基对内蒙古赤峰市4个地点的5种树木根际土壤样品中的固氮菌进行分离、提纯,共获得116株固氮菌株,基于16S r DNA序列最大相似性进行了分析鉴定。结果表明:红山区落叶松根际土壤中的固氮菌共有6个属,以芽孢杆菌属(Bacillus)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii)为主;松山区樟子松根际土壤中的固氮菌共有8个属,以节细菌属(Arthrobacter)和链霉菌属(Streptomyces)为主。旺业甸落叶松根际土壤中的固氮菌共有6个属,以芽孢杆菌属(Bacillus)和根癌土壤杆菌属(Agrobacterium tumefaciens)为主;旺业甸白桦根际土壤中的固氮菌共有4个属,假单胞菌属(Pseudomonas)为主。红山区白皮松根际土壤中的固氮菌共有5个属,以假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)为主。新城区白皮松根际土壤中的固氮菌共有10个属,以假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii)为主。从固氮菌种群分布看,新城区白皮松根际土壤中固氮菌种群分布最为广泛,从中分离的19株固氮菌分布在10个属内;节细菌属(Arthrobacter)固氮菌分布最为广泛,存在5种树种的根际土壤中。

【全文】 文献传递



内蒙古赤峰地区主要树种根际固氮菌的分离和鉴定

田国杰，王 晗，陈立红

(内蒙古农业大学 农学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

摘　要：用阿须贝培养基对内蒙古赤峰市4个地点的5种树木根际土壤样品中的固氮菌进行分离、提纯，共获得116株固氮菌株，基于16S rDNA序列最大相似性进行了分析鉴定。结果表明：红山区落叶松根际土壤中的固氮菌共有6个属，以芽孢杆菌属(Bacillus)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii)为主；松山区樟子松根际土壤中的固氮菌共有8个属，以节细菌属(Arthrobacter)和链霉菌属(Streptomyces)为主。旺业甸落叶松根际土壤中的固氮菌共有6个属，以芽孢杆菌属(Bacillus)和根癌土壤杆菌属(Agrobacterium tumefaciens)为主；旺业甸白桦根际土壤中的固氮菌共有4个属，假单胞菌属(Pseudomonas)为主。红山区白皮松根际土壤中的固氮菌共有5个属，以假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Bacillus)为主。新城区白皮松根际土壤中的固氮菌共有10个属，以假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii)为主。从固氮菌种群分布看，新城区白皮松根际土壤中固氮菌种群分布最为广泛，从中分离的19株固氮菌分布在10个属内；节细菌属(Arthrobacter)固氮菌分布最为广泛，存在5种树种的根际土壤中。

关键词：赤峰；固氮菌；16S rDNA

固氮菌是一类将大气中的氮转化为植物可利用的铵的细菌，是氮循环中的重要组成部分，广泛存在于各种生态系统中[3]，对生态系统中可利用氮素有着重要的补充作用。据统计，每年地球陆地生态系统由生物固氮作用固定的氮量约为90～130×106 t纯氮[4]，而2005-2006年度世界工业生产的化学氮肥约为90.9×106 t纯氮[5]。因此，固氮菌可以说是自然界中名副其实的固氮工厂。而土壤中的固氮菌数量庞大，与共生固氮菌相比，虽然其固氮能力较弱，但它不需要与特定的植物配合，同时具有资源量大、分布广泛、适应强等特点[6]。与此同时，固氮菌还参与光合作用，确保生物圈的生产力[7]。一些土壤中的固氮细菌还能通过合成、释放抗生素以及生长物质促进植物生长[8,9]，增强植物抗病、抗逆能力。因此，在发展可持续农业生产上，固氮菌已经成为满足人类需求、保护自然环境的最好选择[10,11]。目前，利用固氮菌生产的生物肥料已经逐渐进入市场，这表明人们对固氮菌的利用又有了新的进展。所有的事实证明，深入对固氮菌的研究，已经成为改变农林生产，进而改变人类生活的重要课题。

本研究以赤峰市红山区、新城区、松山区以及喀拉沁旗旺业甸地区不同树种根际土壤为材料，分别对其进行固氮菌的分离，通过进行基因序列分析，检测了不同树种根际固氮菌的种类，了解其在根际土壤中的分布，为确定该地区不同微生态环境下土壤中固氮菌种质资源做初步探索，同时，对保藏及合理利用固氮菌资源以维持赤峰林业生态平衡具有深远意义。

1　材料与方法

1.1　土样采集

据吴丽芝等调查数据显示，赤峰森林面积293.27万hm2，森林覆盖率为34.16%[12]。采取落叶松(红山区，旺业甸)，白皮松(红山区，新城区)，樟子松(松山区)，白桦(旺业甸)根际土壤样品，5个重复，样品于封口袋中，4℃保存。

1.2　固氮菌的分离和纯化

将每个树种5个土壤样品混合后，称取新鲜混合土样各1 g，加入灭菌的三角瓶中，再于每个三角瓶中加入99 mL无菌水，摇床振荡30 min制成菌悬液，静止15 min待用。取上清液各1 mL于已加入9 mL无菌水的试管中作梯度稀释，震荡均匀即稀释为10-3溶液，依从稀释到10-3、10-4、10-5，选取3个稀释度(10-3，10-4，10-5)的菌悬液0.1 mL于Ashby无氮培养基上，用无菌玻璃棒涂抹均匀，28℃倒置培养4～5 d，每个稀释度做3个重复。

统计固氮菌的菌落数量。用牙签分别挑取单菌落，接种到新鲜的无氮培养基上，28℃培养4～5 d后，连续划线3～5次，直到纯化，菌株保存于4℃冰箱。

1.3　16S rDNA的扩增

采用SDS法提取细菌基因组DNA。以DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物27F/1492R进行扩增。PCR扩增反应总体系为25 μL，DNA模板2.0 μL，Taq Mix12.5 μL，正向引物1.0 μL，反向引物1 μL， ddpO 8.5 μL。PCR扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃再延伸15 min。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.4　16S rDNA的测序

扩增样品由上海生物工程有限公司进行 16S rDNA 测序。将测定的序列在GenBank(NCBI)数据库上进行序列比对，获得16S rDNA相似性最大的菌株。

2　结果与分析

2.1　不同树种根际固氮菌数量分布

本研究采用平板计数法统计各样品固氮菌菌落数量，选取10-4释度进行计数统计(表1)。结果表明，不同树种根际土壤固氮菌数量虽有所不同，但都处在同一数量级水平。红山区落叶松以及旺业甸白桦根际土壤固氮菌数量较多于其他树种根际土壤固氮菌的数量，固氮菌菌落数量约是其他树种的3～6倍；旺业甸落叶松、新城区松山区樟子松根际土壤固氮菌菌落的数量集中在200～300个/mL(104释度)；而红山区和新城区白皮松以及红山区垂柳根际土壤固氮菌数量相对较少。各种树种根际土壤固氮菌菌落类型在5～10种之间。

2.2　固氮菌菌株的鉴定

通过对所有树种根际土壤自生固氮菌的分离、纯化，共从中选取出116株长势较好的菌株进行DNA测序，将测序结果在NCBI网站进行同源比较，获得相似性最大的菌株(表2)。

16S rDNA序列对比结果显示，从赤峰采集的落叶松、白皮松、白桦、樟子松根际土壤分离出的固氮菌株有106株与已知最大相似菌株的相似性达97%以上。按照16S rDNA序列对比结果，相似性在97% 以上的固氮菌类群分别属于假单胞菌(Pseudomonas)、节细菌属(Arthrobacter)、类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、伯克氏菌(Burkholderia)、贪铜菌(Cupriavidus)、北纳创联马赛菌(Massilia)、不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、变黑杜檊氏属(Duganella nigrescens)、蒂莫内马赛菌(Massilia timonae)、嗜热短芽孢杆菌(Brevibacillus thermoruber)、白色类诺卡氏菌(Nocardioides albus)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、Dyadobacter、Pseudoduganella sp、Glycomyces sp. 21个属(表 2)。其中以假单胞菌(Pseudomonas)(24株)、芽孢杆菌属(Bacillus)(23株)、节细菌属(Arthrobacter)(18株)、链霉菌属(Streptomyces)(14株)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii)(12株)数量最多。其余10株16S rDNA的相似性小于97%的菌株分别是分离自红山区落叶松的根际土壤(1株)、红山区白皮松的根际土壤(1株)、新城区白皮松的根际土壤(2株)、旺业甸白桦的根际土壤(1株)。

在红山区落叶松根际土壤中共分离出16株固氮菌，对比结果显示，除1株固氮菌的16S rDNA序列与已知最大相似菌株的相似性为94%(其最大相似结果显示为类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii))，其余菌株相似性均达到97%以上。它们分别属于链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、节细菌属(Arthrobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii)、芽孢杆菌属(Bacillus)以及Glycomyces sp. 6个属(表1)。

在旺业甸落叶松根际土壤中共分离出14株固氮菌，通过对比显示，所有菌株的16S rDNA序列与已知最大相似菌株的相似性均大于97%。它们分别属于链霉菌属(Streptomyces)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、假单胞菌属(Pseudomonas)、节细菌属(Arthrobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii)以及芽孢杆菌属(Bacillus)6个属。

在红山区白皮松根际土壤中共分离出17株固氮菌，对比结果显示，除1株固氮菌的16S rDNA序列与已知最大相似菌株的相似性为96%外(其最大相似结果显示为芽孢杆菌属(Bacillus)，其余菌株相似性均达到97%以上。它们分别属于假单胞菌属(Pseudomonas)、节细菌属(Arthrobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)以及芽孢杆菌属(Bacillus)5个属。

续表2(Continued Table 2)

续表2(Continued Table 2)

在新城区白皮松根际土壤中共分离出19株固氮菌，对比结果显示，除2株固氮菌的16S rDNA序列与已知最大相似菌株的相似性为96%(其最大相似结果显示为Dyadobacter和类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii))，其余菌株相似性均达到97%以上。它们分别属于假单胞菌属(Pseudomonas)、节细菌属(Arthrobacter)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii)、芽孢杆菌属(Bacillus)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、链霉菌属(Streptomyces)、贪铜菌(Cupriavidus)、变黑杜檊氏属(Duganella nigrescens)以及Pseudoduganella sp 10个属。

在旺业甸白桦根际土壤中共分离出15株固氮菌，对比结果显示，除1株固氮菌的16S rDNA序列与已知最大相似菌株的相似性为95%外，其余菌株相似性均达到97%以上(其最大相似结果显示为假单胞菌属(Pseudomonas))。它们分别属于假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、节细菌属(Arthrobacter)以及伯克氏菌(Burkholderia)4个属。

在松山区樟子松根际土壤中共分离出16株固氮菌，对比结果显示所有菌株的16S rDNA序列与已知最大相似菌株的相似性均达到97%以上(表1)。它们分别为链霉菌属(Streptomyces)、节细菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus elgii)、芽孢杆菌(Bacillus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白色类诺卡氏菌(Nocardioides albus)以及叶杆菌属(Phyllobacterium)8个属。

3　讨论与结论

固氮菌广泛分布在自然界的土壤中，是土壤生态系统中功能菌群之一，在土壤氮循环中发挥着不可替代的作用[13]。因此，对植物根际土壤中固氮菌的研究一直是人们关注的焦点之一。李姝江等曾在四川核桃主产区根际土壤中分离出芽孢杆菌属(Bacillus)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、叶杆菌属(Phyllobacteraum)、根瘤菌属(Sanorhazobaum)、固氮菌属(Azotobacter)、固氮螺菌属(Azospirillus)、肠杆菌(Enterobacter)和节杆菌属(Arthrobacter)9种固氮菌；其中假单胞菌属(Pseudomonas)和固氮菌属(Azotobacter)为优势属[14]。樊俊华等从地毯草根际土壤中分离出6株固氮菌株，经鉴定分别属于芽抱杆菌属(Bacillus)、固氮菌属(Azotobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)[15]。杨海莲从水稻根际分离到假单胞菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、葡萄球菌(Staphylococcus)[16]及姚拓从高寒地区燕麦根际中分离到的固氮菌属(Azotobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和固氮螺菌属(Azospirillus)[17]。这些研究成果都说明根际土壤中的固氮菌的数量和种类都是较为庞大的。

从鉴定结果来看(表2)，本试验从赤峰市不同地点的落叶松、白皮松、白桦、垂柳以及樟子松根际土壤中共分离出共21个属的116株固氮菌，其中以假单胞菌属(Pseudomonas)、芽抱杆菌属(Bacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii)和链霉菌属(Streptomyces)为优势菌株。这些结果反映出赤峰地区土壤中固氮菌的种群多样性较为丰富。

参考文献:

[1]　M.P.Raimam,U.Albino,M.F.,et al.Interaction among free-living N-fixing bacteria isolated from Drosera villosa var.Villosa and AM fungi (Clomus clarum) in rice (Oryza sativa)[J].Applied Soil Ecology, 2007,35:25-34.

[2]　 L R. Kennedy，A.T. M.A. Choudury，M. L. Kecskes. Non-symbiotic bacterial diazotrophs in crop-farming systems: Can their potential for plant growth promotion be better exploited?[J].Soil Biology and Biochemistry, 2004,36:1229-1234.

[3]　Zehr J P, Jenkins B D,Short S M,et al. Nitrogenase gene diversity and microbial community structure: a cross-system comparison[J]. Environ Microbiol, 2003,5:539-554.

[4]　Galloway J N, Schlesinger W H, Levy II H, et al. Nitrogen fixation: anthropogenic enhancement environmental response[J]. Global Biochemical Cycles,1995,9:235-252.

[5]　Heffer P, Prud'homme M. Medium-term outlook for global fertilizer demand，supply and trade，2006-2010[M]. Paris: International Fertilizer Industry Association, 2006.

[6]　Day J M D Harris, P J Dart, et al. The Broadbalk experiment. An investigation of nitrogen gains from non-symbiotic nitrogen fixation[A]. In W. D. P. Steward (ed.). Nitrogen fixation by free-living microorganisms [C]. London: Cambridge University press， 1975.71-84.

[7]　Peoples，M.B., Herridge, D.F. Ladha, J.K..Biological Nitrogen Fixation: An Efficient Source of Nitrogen for Sustainable Agricultural Production[J]. Plant Soil,1995,174:3-28.

[8]　Aquilanti L, Mannazzu I, Papa R, et al. Amplified ribosomal DNA restriction analysis for the characterization of Azotobacteraceae: a contribution to the study of these free-living nitrogen-fixing bacteria[J].Microbiol Methods, 2004,57:197-206.

[9]　Beneduzi A, Peres D, da Costa P B, et al. Genetic and phenotypic diversity of plant-growth-promoting bacilli isolated from wheat fields in southern Brazil [J]. Res Microbiol, 2008,159:24-50.

[10]　Giller K E, Cadisch G. Future benefits from biological nitrogen fixation: an ecological approach to agriculture [J]. Plant Soil, 1995,174:255-277.

[11]　Vance C P. Enhanced agricultural sustainability through biological nitrogen fixation [A]. In: Legocki A, Bothe H, Piihler A (eds). Biological fixation of nitrogen for ecology and sustainable agriculture[C]. Berlin: Springer, 1997.179-186.

[12]　吴丽芝,姚云峰,王雄,等.赤峰市森林资源系统可持续发展力动态评价能[J].内蒙古大学学报,2014,45(2):176-183.

[13]　张晶,张惠文,苏振成,等.长期有机污水灌溉对土壤固氮细菌种群的影响[J].农业环境科学学报,2007,26(2):662-666.

[14]　李姝江,朱天辉,崔晓亮.四川核桃主产区根际土壤固氮细菌筛选及多样性研究[J].土壤通报, 2014,45(1):199-204.

[15]　樊俊华,赵晓波,赵艳.地毯草根际固氮菌的分离及鉴定[J].东北农业大学学报,2012,43(8):105-109.

[16]　杨海莲,孙晓璐,宋未.水稻内生联合固氮细菌的筛选、鉴定及其分布特性[J].植物学报,1999,41(9):927-931.

[17]　姚拓,龙瑞军,王刚,等.兰州地区盐碱地小麦根际固氮菌分离及部分特性研究[J].土壤学报,2004,(3):23-28.

Isolation and Determination of Nitrogen-fixing Bacteria in Rhizosphere of Main Tree Species in Chifeng, Inner Mongolia

TIAN Guo-jie, WANG Han, CHEN Li-hong

(Agricultural College, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010019, China)

Abstract：Ashby nitrogen-free culture medium was used for isolating and purifying nitrogen-fixing bacteria strains from the rhizosphere of five kinds of trees and four locations of Chifeng in Inner Mongolia. 116 pure cultures of nitrogen-fixing bacteria strains were obtained, and identified by 16S rDNA sequences. The results indicated that these nitrogen-fixing bacteria were isolated from the rhizosphere of Larix gmelinii in Hongshan District belonged to 6 genera based on 16S rDNA sequence similarity, mainly including Bacillus, Paenibacillus. These nitrogen-fixing bacteria were isolated from the rhizosphere of Pinus sylvestris in Songshan District belonged to 8 genera based on 16S rDNA sequence similarity, mainly including Arthrobacter, Streptomyces. The nitrogen-fixing bacteria were isolated from the rhizosphere of Larix gmelinii in Wangyedian belonged to 6 genera, mainly including Bacillus, Agrobacterium. The nitrogen-fixing bacteria were isolated from the rhizosphere of Betula platyphylla in Wangyedian belonged to 4 genera, mainly including Pseudomonas. The nitrogen-fixing bacteria were isolated from the rhizosphere of Pinus bungeana in Hongshan District belonged to 5 genera, mainly including Pseudomonas, Bacillus. The nitrogen-fixing bacteria were isolated from the rhizosphere of Pinus bungeana in Xincheng District belonged to 10 genera，mainly including Pseudomonas, Bacillus and Paenibacillus. From the view of population distribution, the nitrogen-fixing bacteria isolated from the rhizosphere of Pinus bungeana in Xincheng District had distributed in the widest range, there were 10 genera from 19 isolated strains.The most widely distributed nitrogen-fixing bacteria was Arthrobacter, existed in the rhizosphere of all sampled trees.

Key words: Chifeng; nitrogen-fixing bacteria; 16S rDNA.

中图分类号：Q939.11

　　　文献标识码：A

文章编号：1007-4066(2016)01-21-06

作者简介：田国杰(1989-)，男，内蒙古宁城县人，硕士研究生，主要从事固氮菌方向的研究。通讯作者：陈立红(1969-)，女，内蒙古呼和浩特人，副教授，主要从事林木生物技术的研究。

基金项目：国家自然科学基金项目(31260173)资助

收稿日期：2016-01-15