偃松(Pinus pumila)为松科(Pinaceae)灌木状小乔木，主要分布在大兴安岭、小兴安岭、张广才岭、老爷岭、长白山等地海拔1 000 m以上区域，是寒温带地区重要的坚果来源和潜在的木本油料植物[1].偃松种仁营养丰富，含油量高.其中，不饱和脂肪酸含量高达59.4%；油脂成分类似于杏油和橄榄油，可用于食品、医药及化妆品行业[2-3].

乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)是脂肪酸合成的关键酶.在植物中，乙酰辅酶A羧化酶主要有异质型和同质型两种.异质型ACCase由生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein，BCCP)亚基、生物素羧化酶(biotin carboxylase，BC)亚基、羧基转移酶(carboxyl transferase，CT)的α-CT亚基和β-CT亚基等4种亚基组成，参与脂肪酸的合成[4-5].其中，α-CT亚基、BCCP亚基和BC亚基分别由核基因accA，accB和accC编码；β-CT亚基由质体基因组中的accD编码[6].异质型ACCase是植物种子脂肪酸合成的关键酶，与种子含油量密切相关[7].其中，β-CT亚基是异质型ACCase的限制因子，在植物ACCase活性和植物种子含油量中起重要作用[8].近年来，随着对β-CT亚基研究的不断深入，人们已从苜蓿(Medicago truncatula)、石栗(Aleurites moluccana)、油棕(Elaeis guineensis)等多种农作物和木本植物中克隆到β-CT亚基的编码基因accD[9-11].由于特有的生命周期长，基因组结构复杂，遗传操作困难等生物学特性，有关针叶树accD基因的研究还未见报道.因此，笔者利用生物信息学方法对偃松accD基因的核酸/蛋白质序列分子特征、一级结构、二级结构以及三维结构进行预测，并对该基因进行系统进化分析，从而为针叶树accD基因的克隆和功能验证提供理论和实践参考.

1 材料及方法

1.1 材 料

参照NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中已报道的偃松(P.pumila，EF523978.1)、奄美松(P.amamiana，JN854226.1)、台湾五针松(P.morrisonicola，JN854182.1)、不丹松(P.wallichiana，JN854154.1)、白皮松(P.bungeana，JN854223.1)、西伯利亚红松(P.sibirica，KT723438.2)、日本白松(P.parviflora，EF523979.1)、红松(P.koraiensis，EF523977.1)、华南五针松(P.kwangtungensis，JN854153.1)、华山松(P.armandii，KP412541.1)、北美乔松(P.strobus，FJ899560.1)、高山松(P.densata，JN854209.1)、火炬松(P.taeda，KC427273.1)accD基因的mRNA序列以及相应的氨基酸序列.

1.2 方 法

利用NCBI对偃松accD基因进行BLAST(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，使用ORFFinder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)进行开放阅读框分析；使用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam)分析偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基氨基酸序列的相对分子质量、碱基分布和氨基酸组成；利用Protscale(http：//web.expasy.org/protscale)预测亲疏水性；利用SignnalP-4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行信号肽预测；使用TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)分析氨基酸序列的跨膜结构域；使用SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org)进行同源建模，构建三维结构示意图；利用MEGA5(www.mega.co.nz)构建偃松等13个松属植物的accD基因序列同源进化树.

2 结果与分析

2.1 同源性

偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基在Genbank中的登录号为EF523978.1.根据登录号进行BLAST，发现在松属植物中共有29条序列与偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基的氨基酸序列相似.其中，不丹松、白皮松、台湾五针松和红松与偃松accD基因的相似度高达100%(见图1).

2.2 开放阅读框

利用ORFFinder对偃松accD基因进行开放阅读框分析，获得1条长428 bp的开放阅读框，起始密码子位于1 bp，终止密码子位于428 bp.共得到3个ORF，其中，ORF1起始于136位，结束于219位；ORF2起始于308位，结束于>427位；ORF3起始于239位，结束于144位.该核苷酸序列是一个无打断的碱基序列，序列中间不存在终止密码子，可完整编码相应蛋白(见图2).

2.3 氨基酸组成

ProtParam分析表明，偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基的分子式为C213H344N44O48S2，相对分子质量为4 353.46，共含有11种氨基酸.其中，亮氨酸的比例最高，占所有氨基酸的25%，其后依次为色氨酸(20%)、异亮氨酸(12.5%)、天冬氨酸(10%)、缬氨酸(7.5%)、苯丙氨酸(7.5%)、丝氨酸(5%)、蛋氨酸(5%)、丙氨酸(2.5%)、甘氨酸(2.5%)、苏氨酸(2.5%).不稳定指数为79.13，为不稳定蛋白质(见图3).

图1 偃松accD基因的BLAST比对结果
Fig.1 BLAST comparison of accD gene in Pinus pumila

图2 偃松accD基因的开放阅读框分析
Fig.2 Open reading frame of accD gene in Pinus pumila

图3 偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基蛋白质氨基酸组成
Fig.3 Amino acid composition of acetyl-CoA carboxylase β-CT subunit in Pinus pumila

2.4 蛋白质亲疏水性

组成偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基的氨基酸分子具有一定极性，这些极性氨基酸对蛋白质高级结构的形成具有重要影响.Protscale分析结果表明，该基因编码的氨基酸有50%以上得分为正值，说明该蛋白为亲水性蛋白.其中，最高得分为1.9，出现在350 bp；最低得分为-0.4，出现在20，235和380 bp(见图4).

2.5 信号肽预测

在起始密码子后有一段疏水性氨基酸序列，负责把蛋白质引导到不同膜结构的亚细胞器内，这段氨基酸序列被称为信号肽序列.利用SignalP-4.1分析偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基发现，C的最大值为0.105，出现在第35个氨基酸上；Y的最大值为0.164，出现在第5个氨基酸上；S的最大值为0.255，出现在第2个氨基酸上(见图5).由此可知，该基因序列分值较低且没有信号肽剪切位点，因此不具有信号肽，说明该蛋白质不属于分泌蛋白.

图4偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基的亲疏水性Fig.4Hydrophobicandhydrophilicpropertiesofacetyl-CoAcarboxylaseβ-CTsubunitinPinuspumila图5偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基的信号肽预测Fig.5Signalpeptidepredictionofacetyl-CoAcarboxylaseβ-CTsubunitinPinuspumila

图6 偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基的跨膜结构
Fig.6 Transmembrane domain of acetyl-CoA carbox- ylase β-CT subunit in Pinus pumila

2.6 蛋白质跨膜区

蛋白质跨膜区连接细胞内、外，主要功能是固定和介导信号传递.TMHMM Server v.2.0分析表明，偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基有1个跨膜结构域，多肽链1～14位于膜外，15～37横跨质膜，38～40位于膜内(见图6)，由此可推断，偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基在质膜上发挥功能.

2.7 蛋白质三维结构

利用SWISS-MODEL中的自动方式(automated mode)进行同源建模，预测偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基的三维结构.结果发现，该蛋白主要由螺旋结构和链状结构组成，其中，螺旋结构大约占75%(见图7).

2.8 系统进化树构建

利用MEGA5构建偃松accD基因的系统进化树，发现该进化树主要分为两个类群.其中，偃松与日本白松、红松聚为一个类群(见图8)，说明偃松、日本白松和红松的accD基因亲缘性较近，这可能与这3个树种的地理分布区相似有关.

图7偃松乙酰辅酶A羧化酶β-CT亚基的三维结构Fig.7Three-dimensionalstructureofacetyl-CoAcar-boxylaseβ-CTsubunitinPinuspumila图8偃松accD基因的系统进化树Fig.8PhylogenetictreeaccDgeneinPinuspumila

3 结论与讨论

乙酰辅酶A羧化酶是催化种子脂肪酸合成最关键的限速酶.大量研究表明，乙酰辅酶A羧化酶的 BCCP，BC，α-CT和β-CT亚基中任何一个亚基基因的过量表达均可提高种子的含油率[12-13].植物中β-CT亚基由质体基因accD编码，在叶绿体中与α-CT亚基的前体蛋白结合，形成乙酰辅酶A羧化酶三大功能结构域之一的羧基转移酶[14].本次研究在NCBI中找到了偃松accD基因序列，该序列长428 bp，与不丹松、白皮松、台湾五针松和红松的相似度高达100%；accD基因系统发育树表明，偃松与日本白松和红松聚为一个类群；编码的蛋白质含有11种氨基酸，为亲水性蛋白，在质膜上发挥功能.以上研究结果可为今后深入研究偃松accD基因及通过基因工程进行遗传改良提供参考.

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[2] 赵垦田，李玉昌，张桂玲.大兴安岭偃松林资源及其开发利用与保护[J].国土与自然资源研究，1997(2)：55-59.

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