白皮松种子抗老化最适含水量的选择及其机制分析
【类型】期刊
【作者】王永超，郭素娟，马履一（北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室）
【作者单位】北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室
【刊名】种子
【关键词】 白皮松；超干；抗老化；MDA；抗氧化酶
【ISSN号】1001-4705
【页码】P52-55
【年份】2019
【期号】第4期
【期刊卷】1;|7
【摘要】试验通过控制超干处理时间获得不同含水量的白皮松种子(7.12%、5.10%、3.21%和1.18%),对这些不同含水量的超干种子进行老化及引发处理,测定白皮松种子电导率、MDA、SOD、CAT和POD等生理指标。结果表明,经引发处理后的低含水量的白皮松种子的SOD、CAT和POD的活力比对照种子的活力高,丙二醛的含量比对照种子的含量低,对照种子的电导率明显高于低含水量的种子,低含水量的种子抗老化能力提高,含水量3.21%的白皮松种子抗老化能力最高。
【全文】 文献传递
白皮松种子抗老化最适含水量的选择及其机制分析
摘要:试验通过控制超干处理时间获得不同含水量的白皮松种子(7.12%、5.10%、3.21%和1.18%)，对这些不同含水量的超干种子进行老化及引发处理，测定白皮松种子电导率、MDA、SOD、CAT和POD等生理指标。结果表明，经引发处理后的低含水量的白皮松种子的SOD、CAT和POD的活力比对照种子的活力高，丙二醛的含量比对照种子的含量低，对照种子的电导率明显高于低含水量的种子，低含水量的种子抗老化能力提高，含水量3.21%的白皮松种子抗老化能力最高。
关键词： 白皮松;超干;抗老化;MDA;抗氧化酶
以收集种子为主体的植物种质资源基因库保存种质，被认为是植物资源保护最可行的方法。低温或者超低温保存是植物种质资源保存的主要方法，但是通常投资大，耗资多，常年运行费高。在经济不发达地区是难以实现的。因此，迫切需要寻求一种廉价的种子保存方法［1］。
种子的含水量和贮藏温度是影响种子贮藏最重要的两个因素，超干贮藏主要是通过降低种子含水量(MC＜5%)，从而降低对库温的要求，达到相近的贮藏效果而节约贮藏费用。由于种子超干贮藏既经济又简单，已成为国际植物遗传资源委员会(IPGRI)近年来资助的重点研究项目。郑光华先生1989年在Nature上发表文章，标志着我国在种子种质节能保存新技术研究领域获得了突破性进展［2］。超干贮藏在农作物种子上的研究较多，涉及到林木种子上的研究却较少。而有关白皮松种子的超干处理和贮藏的研究未见报道，本研究采用室温硅胶干燥法处理白皮松种子，分析了不同含水量的白皮松种子的发芽和生理生化特性的变化，探讨白皮松种子超干处理和贮藏的可行性，为白皮松种子的常温贮藏提供了理论依据，在白皮松种子贮藏研究方面具有一定的理论意义和应用价值。
1 材料与方法
1.1 材 料
本试验的白皮松种子产于山西省运城市绛县，种子的初始含水量为11.21%，发芽率为88%。
1.2 方 法
1.2.1 种子的超干处理与贮藏
种子的超干处理采用硅胶干燥法［3］:将种子置于尼龙网袋，埋于干燥器内硅胶中，硅胶与种子重量比为5∶1，于室温下(白天25℃，夜晚15℃)脱水干燥，每天定时更换120℃充分冷却的干燥硅胶，每隔一定时间称重，以制备含水量分别为7.12%(国家标准安全含水量范围内，试验对照)、5.10%、3.21% 和 1.18% 的种子，然后把不同含水量的种子密封于双层铝箔袋中，贮藏于室温条件下。
1.2.2 人工老化与引发
根据程红焱等［4］方法，把密封于双层铝箔袋中的不同含水量的种子放入干燥的具塞试管中，在50℃恒温条件下老化20 d后，顺序放入饱和CaCl2水溶液(20℃相对湿度为35%)、饱和NaCl水溶液(20℃相对湿度为70%)以及蒸馏水(20℃相对湿度为100%)所平衡的干燥器中，密封，各平衡48 h，进行逐级回水处理。
1.3 种子发芽率测定
按《林木种子检验规程》GB－2722－1999的技术标准进行。4个重复，发芽率(%)=发芽的种子数/共检测的种子数×100%。
1.4 电导率测定
采用宋红等［5］的方法测定电导率:每组取10粒种子称重，3个重复，用去离子水冲洗数次，吸干表面水分，置于100 ml三角瓶中，加入100 ml去离子水，放在25℃恒温箱中24 h，用电导率仪测定种子浸出液的电导率。测的值除以其重量，计算单位质量的电导率。
1.5 丙二醛的测定
参照朱诚等［6］的方法，丙二醛在高温及酸性条件下可与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的产物，测定该物质在532、600 nm和450 nm处的吸光度。
1.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定
采用SOD抑制抑制氮兰四唑(NBT)在光下的还原作用来测定超氧化物歧化酶的活性。
1.7 过氧化氢酶(CAT)活性的测定
H2O2对240 nm波长的紫外光具有强吸收作用，CAT能催化H2O2分解为H2O和O2，因此在反应体系中加入CAT会使反应液的吸光度随反应时间降低，根据A240的变化率可计算出CAT的活性。
1.8 过氧化物酶(POD)活性的测定
采用愈创木酚法测定种子中过氧化物酶的活性。
1.9 数据分析
方差分析与多重比较应用Spss 16.0软件辅助完成。
2 结果与分析
2.1 超干处理对白皮松种子抗老化能力的影响
对不同含水量的白皮松种子进行20 d，50℃的老化处理，老化前后各自的发芽情况与初始种子的比较结果如图1所示。
图1 老化对不同含水量的白皮松种子发芽的影响
从图1可以看出，不同含水量的种子在老化前与初始白皮松种子的发芽率相比变化不大，表明白皮松种子有较强的耐脱水性;经过老化处理后，各个含水量梯度的发芽率都下降，对照种子(含水量11.21%的种子)的发芽率尤为明显，下降了28%，相比之下低含水量的种子下降的比较小，含水量3.21%的种子下降最小，仅3%，达到了白皮松种子超干处理的发芽最高峰(83.5%)，说明白皮松种子含水量在3.21%左右时，仍保持较高的发芽率，但是含水量下降至1.18%时，发芽率下降，但下降率仍低于对照的种子，说明降低含水量能够提高白皮松种子的抗老化能力，但具有一个适度的含水量水平，并不是越低越好。
2.2 超干处理对白皮松种子细胞膜系统的影响
测定老化前后不同含水量白皮松种子的电导率，与初始种子的变化情况如图2所示。
图2 老化对不同含水量白皮松种子电导率的影响
白皮松种子超干处理后，其电导率变化不大，但随着含水量的下降，电导率逐渐增大;老化处理后与老化前相比，各含水量梯度的白皮松种子的电导率都增加，对照种子的增幅最大，增加了39%，与老化前相比达到了极显著水平，低含水量的种子增幅较小，含水量3.21%增幅最小，与老化前相比差异不显著，脱水过于严重的含水量1.18%的种子与老化前相比也达到了极显著水平，但是与对照相比，电导率增幅较小，只增加了12%。结果表明:超干使白皮松种子的膜结构和功能受到一定的影响，但是与对照相比提高了种子的抗老化能力，适度超干的抗老化能力最强，与发芽试验得到的结果相类似。
细胞膜系统受伤害与否的另一个重要指标就是丙二醛(MDA)的含量，它是膜脂过氧化的产物，其积累会严重损伤生物膜，使种子不能正常萌发。在老化处理前，含水量低的白皮松种子的MDA含量均高于对照种子(如图3所示)，而老化处理对各种子中MDA的含量均有不同程度的促进作用，但是含水量低的种子中MDA含量增加的幅度明显低于对照的种子，如含水量3.21%的种子中MDA含量上升了21%，而对照种子中MDA含量上升了53%，过度超干的种子则上升了30%。表明适度超干种子老化过程中膜脂过氧化作用比未超干的种子发生程度轻，膜结构和功能保持完好，因而其抗老化能力得到提高。
图3 老化对不同含水量白皮松种子MDA含量的影响
2.3 超干种子人工老化后抗氧化酶系统的变化
图4 老化对不同含水量白皮松种子SOD、CAT和POD活性的影响
人工老化处理对白皮松种子内抗氧化系统的影响是不同的(如图4所示)。老化处理后种子内的SOD活性下降，对照种子老化后SOD活性降幅为30%，过度超干的种子降幅为26%，含水量为3.21%和5.10%种子的降幅分别为10%和20%。同样，CAT和POD的活性在老化处理后也下降，与SOD的下降规律相似。以上结果表明，适度降低种子含水量可提高种子的抗氧化能力，含水量为3.21%提高的效果最明显，有效提高种子的抗老化能力，但是种子含水量过低，并不能提高其抗氧化能力。
3 结论与讨论
种子的含水量是影响种子贮藏的最重要的因素之一［7］。利用4个含水量梯度来研究白皮松种子的生理过程和含水量间的关系。研究结果表明:含水量低的白皮松种子经过老化处理后依然可以保持较高的发芽率，而随着含水量的升高种子的发芽率降低。为了使种子的长期贮藏后依然保持较高的生活力和较高的发芽率，用低含水量的方法是完全行得通的，这与李毅等［8］对沙冬青和霸王种子与邹冬梅［9］对银合欢种子超干贮藏研究得到的结果是一致的。试验结果表明:含水量为3.21%的水平最适合白皮松种子的超干贮藏。
选择透过性是细胞膜的主要特征之一［10］。在老化种子中由于膜系统的破坏，许多物质从细胞内渗透到细胞外，最终种子的活力降低。种子吸水过程中电导率的变化通常用来检验细胞膜完整性。研究表明:低含水量的种子在老化处理后，电导率很低，说明膜系统保持的很好。而当含水量过低时，电导率升高，说明膜系统被破坏，最终种子的发芽率降低，抗老化能力下降。
自由基是一类具有奇数电子的分子、原子和离子，游离在细胞中具较强的氧化能力，能引发膜上不饱和脂肪酸过氧化反应，形成MDA等多种过氧化物的降解产物，对生物膜起严重的破坏作用，MDA的含量常用来表示种子中脂质过氧化程度。研究发现，经过人工老化后，对照种子的MDA含量的增加幅度明显大于超干种子，其中以适度超干处理的白皮松种子(3.21%)增幅最小，说明适度超干处理在一定程度上抑制了种子在老化过程中自由基的产生，并且提高了抗脂质过氧化的能力，在老化过程中其内部膜脂过氧化作用比对照种子的发生程度轻。其原因可能是种子含水量降低到一定程度时，细胞质处于玻璃化状态，在这种状态下种子的呼吸代谢降低到最低水平，酶促反应受到抑制，膜脂过氧化作用被部分抑制，从而保证了超干种子活力维持较高水平。
从试验结果可以看出，超干处理能提高种子抗老化能力的一个可能原因就是种子内SOD、CAT和POD等抗氧化酶系统保持的较完好，一旦种子经吸胀萌动后可以立即恢复酶活性，使种子在老化过程中积累的有毒物质及时得到清除，避免了对膜系统的破坏，保证了超干种子进入正常萌发的状态。种子适度超干与抗老化能力间的关系同样也见于其它报道:如朱诚等［11］在洋葱超干种子抗老化研究中发现的抗氧化酶系统性强于对照种子。胡伟民等［12］研究表明，杂交籼稻在含水量降为5.0%时耐储性最好，而且过过氧化物酶与种子的生活力和活力呈正相关。李毅等［13］在对黄花补血草的研究中得到相同的结果。本试验研究再次证明，适度超干能够提高种子抗老化能力，提高种子贮藏的稳定性。
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Selection Optimum Moisture Content of Pinus bungeana Seeds for Anti-aging and It’s Mechanism Analysis
Abstract:Pinus bungeana Zucc.seeds with different moisture content(7.12%、5.10%、3.21%and 1.18%)were obtained by controlling ultra-drying time，then those seeds were treated by aging and re-water，some physiology indices，including the electrical conductivity，MDA，SOD，CAT and POD were tested.The results indicated that SOD，CAT and POD activities of the low moisture content seeds were higher than that of control seeds，while MDA were lower than the control group.The electrical conductivity showed statistical difference obviously between low moisture content seeds and the control group.The ability of anti-aging were increased，Pinus bungeana seeds with 3.21%moisture content had the highest ability for anti-aging.
Key words: Pinus bungeana;Ultra-dry;Anti-aging;MDA;Anti-oxidation enzymes
中图分类号: S 791.243
文献标志码: A
文章编号: 1001－4705(2010)04-0052-04
收稿日期:2010－01－25